通常孵育功夫与温度成反比 ，即温度越高 ，所需功夫相对较短。最常用的孵育温度为37℃ ，孵育1-2h。 孵育时应贴封片或加盖 ，预防样品或稀释液蒸发 ，吸附于孔壁 ，难于洗濯。孵育时 ，反映板不宜叠放 ，以保障各板的温度都能迅速平衡。同时 ，应严格节造孵育功夫 ，预防因功夫过长导致紧附于反映孔周围的非特异性结合。 孵育时 ，要尽量排除“边缘效应” ，即96孔板的表周孔显色较中心孔深。究其原因 ，是由于96孔板周孔与中心孔的表表或热力学特点分歧。因而 ，可选取水浴或在将反映溶液参与至板孔中时 ，将板和溶液均加热至孵育温度（37℃）
因ELISA的活络度较高 ，则应该按划定将血清稀释至适当的倍数 ，以降低非特异性反映 ，使特异性的抗原抗体反映充分体现出来。 加样品时 ，单孔用量要求：≥20ul/指标 ，如必要做2个复孔则血量≥60ul/指标。若是用量充足 ，最好提供50ul/孔/指标。具体用量也需凭据试剂盒的要求而定。 汲取样品时 ，加样枪头不应粘附有余的液体；加样时不成90度向孔中滴加液体 ，不然会导致液体残留在吸头上 ，加样不正确。正确加样步骤应为45度 ，吸头贴着孔壁和液面的接壤处参与。加样时速度不成过快 ，不然无法保障微量加样的正确性和均一性；要预防样品加在孔壁上部而产生非特异性吸附。不成将样品溅出以预防对邻近孔产生传染
在尝试起头前 ，需将试剂盒从冰箱中拿出来在室温搁置20min ，再进行测定 ，以使试剂盒在使用前与室温平衡 ，也可使温育时反映孔内的温度能较快的达到所要求的高度 ，以满足测定要求。 其次 ，目前商品中ELISA试剂盒中的洗板液均需在尝试过程中对其所提供的浓缩液进行稀释配造 ，因而稀释时所用的蒸馏水或去离子水应该保障质量。此表 ，底物反映液应该反映显色前进行现配现用。同时 ，为了保障尝试的均一性 ，尝试中所有试剂在加样前必须摇匀。
用于ELISA测定最常用的临床标本是血清（浆）。要把稳预防严沉溶血 ，由于血红蛋白中含有拥有类似过氧化物活性的血红素基团 ，在孵育时很容易吸附于固相 ，与HRP底物反映产生假阳性。 样品采集及血清分离中要把稳预防细菌传染 ，一方面细菌排泄的酶可能匹敌原抗体等蛋白产生分化作用 ，另一方面 ，细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶会对相应酶作象征的测定步骤产生非特异性滋扰。 样品应该要预防反复冻融。因反复冻融所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生粉碎作用 ，从而引起假阴性了局。另表 ，样品混匀时 ，不要剧烈振荡 ，反复颠倒混匀即可。 通常而言 ，若是在网络样品确当天进行检测 ，可将样品实时贮存在4℃备用；而对隔天再检测的样本 ，应实时辰装后冻存在-20℃备用 ，若要持久保留样品 ，最好将其置于-70℃冻存。
误差分为三类 ，系统误差、随机误差和错误误差。这三类误差中 ，系统误差对样本值和空缺值之间的差距无影响。ELISA样本值低于空缺值在误差方面重要起源于随机误差和错误误差。 随机误差?Random?Error 无法节造的变因 ，使丈量值产生随机散布的误差 ，遵从统计学上的正态散布。从统计学上来看 ，丈量值有99%的相信限在±3SD之间 ，若是CV值是20% ，随机误差的天堑就是±60% ，也就是说在CV值20%的情况下 ，样本值低于空缺值60%之内 ，有可能是随机误差的影响 ，出格是空缺值只有一个值时。 随机误差不成解除 ，只能通过屡次丈量获得的均值尽量逼近真值。降低随机误差的解决规划1是增长空缺值的沉复数量 ，通常以为空缺值沉复10次 ，丈量均值靠近真值。 规划2是提高尝试技术 ，也可能有效降低随机误差的影响。若是CV值在5% ，样本值趋近于零时 ，在统计上样本值将不会低于空缺值15%。 错误误差?Gross?Error 错误误差重要是由于丈量者的忽略 ，犯了不应有的谬误造成的。错误误差是能够预防的。针对于ELISA样本值低于空缺值的问题 ，错误误差产生的原因无数起源于空缺孔HRP的沉复加样或传染或洗涤不干净 ，造成空缺值偏高 ，相对比来说 ，样本值低于空缺值。解决规划就是沉复尝试 ，规范操作。 基质效应?Matrix?Effect 分析中 ，基质指的是样本中被分析物之表的组分 ，基质时时对分析物的分析过程有显著的滋扰 ，并影响分析了局的正确性 ，这些影响和滋扰被称为基质效应。ELISA试剂盒在开发过程中 ，尺度品不能选取人或动物血清、血浆作为尺度曲线的稀释液 ，只能选取其模仿物。模仿物与被测样本在蛋白丰度、复杂性、pH等成分城市存在差距。当样本的基质与其模仿物相比 ，降低抗原抗体的结合 ，便产生了样本值低于空缺值的景象。造成样本值无法推算出数值 ，或者数值为负。 目前最常用的去除基质效应的步骤是 ，通过已知分析物浓度的尺度样品 ，同时尽可能维持样本中的基质不变 ，成立一个校对曲线（Calibration?Curve）。 当单个样本或少量样本值低于空缺值时 ，可能是误差原因 ，这时应增长沉复 ，提高操作技术。当大量样本都低于空缺值时 ，应试虑基质效应的影响 ，成立校对曲线予以建改。
在ELISA尝试中 ，样本值低于空缺值是一个时时性的问题。当样本值较低靠近试剂盒的活络度就容易产生样本值低于空缺值的景象 ，出格是在血清和血浆样本的检测。究其原因 ，重要在于两个方面 ，一方面是误差 ，另一方面是基质效应。下文逐个分析分歧影响成分的道理、和解决规划。
血清、血浆样品请务必依照说明书要求 ，与稀释液1：1稀释后再加样。这类样品蛋白质含量高且成分复杂 ，容易造成对监测孔上的抗原表位的遮蔽 ，与稀释液1：1稀释后可有效预防这一问题。
温度是ELISA结合反映的沉要影响成分。为了使所有样本在一致的温度下反映 ，尝试前务必将所有试剂平衡至室温 ，蕴含检测样本。预防因温度的动力学反映差距而导致ELISA检测了局的不正确。
首先 ，酶标仪使用前务必预热10-15min ，使测读了局更不变。其次 ，ELISA尝试选取双波长测定吸光度 ，能够排除单波长检测时的测定滋扰（标本的浓度 ，滋扰色等）。通常选取最大波长作为参照波长 ，在参照波长下 ，检测物的吸光值最幼 ，检测波长和参照波长的吸光值之差能够解除非特异性吸收；因而 ，双波长测定 ，可最大限度的解除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差 ，以保障尝试数据的正确度。
振荡孵育使反映更充分 ，振荡洗涤使布景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。孵育过程振荡 ，能够加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触 ，使得反映过程越发齐全 ，OD值通；岜任凑竦捶跤牧司忠；洗涤过程振荡 ，能够使洗板更干净 ，在很大水平上能降低布景值 ，同时能够提高试剂盒检测的活络度。
